Nicht zugelassene ED-Medikamente – ein gefährlicher Markt

Bereits vor dem Patentablauf von Viagra® im Jahr 2013 [19] erschienen Konkurrenzprodukte auf dem Markt, die weder für die medizinische Anwendung zugelassen noch auf ihre Verbrauchersicherheit hin untersucht worden waren – darunter auch synthetische Analoga von Sildenafil. Im Zeitraum von 2002 bis 2014 wurden 39 illegale Wirkstoffe entdeckt [16], am häufigsten: Homosildenafil; Hydroxyhomosildenafil; Hongdenafil; Hydroxyhongdenafil; Aminotadalafil; Piperidenafil und Methiosildenafil [20].

Diese Wirkstoffe können in pflanzlichen Nahrungsergänzungsmitteln, Arzneimitteln unbekannter Herkunft und Pulvern in Großpackungen gefunden werden [20, 21]. Zum Beispiel wurden Homosildenafil und Hydroxyhomosildenafil in pflanzlichen Tabletten gegen Müdigkeit nachgewiesen, die als „pflanzliches Viagra“ verkauft werden [22]. Zou et al. [17] fanden Sildenafil, Homosildenafil, Hydroxyhomosildenafil, Hongdenafil, Vardenafil und Tadalafil in Pulverproben aus Großpackungen, während Do et al. Tadalafil und Sildenafil in 31 kommerziellen Produkten nachweisen konnten [23]. Ein weiteres Sildenafil-Analogon – Isosildenafil – wurde bisher wenig untersucht und ist nicht für die medizinische Anwendung zugelassen [19].

Tatsache ist, dass gefälschte und andere illegale Substanzen, die als seriöse, zugelassene Medikamente angepriesen werden, ein erhebliches Gesundheitsrisiko darstellen. Glibenclamid, Talkumpuder, Amphetamine und Farbstoffe sind nur ein Teil der Unreinheiten, die in illegalen ED-Medikamenten gefunden wurden. Der Gebrauch von sowohl illegalen als auch pharmazeutischen PDE-5-Inhibitoren kann zu Kopfschmerzen, Muskelschmerzen, Übelkeit, Erbrechen, Hitzewallungen und Sehstörungen führen. Und im Falle nicht zugelassener Konzentrationen können Bluthochdruck und ähnliche Nebenwirkungen auftreten. Besonders gefährlich ist dies, wenn die Einnahme zusammen mit anderen gefäßerweiternden Mitteln wie Alkylnitriten, auch bekannt als „Poppers“, erfolgt. Im schlimmsten Fall kann dies sogar zum Tod führen.

Einsatz von UHPLC-MS/MS bei der forensischen Ermittlung von gefälschten Arzneimitteln

Im Rahmen eines Gerichtsverfahrens, bei der es um eine Vergiftung mit Todesfolge ging, bat die zuständige Strafverfolgungsbehörde das Institute of Toxicology Research in Borowa, Polen, um Unterstützung bei der toxikologischen Analyse eines mutmaßlich gefälschten Präparats. Die Wissenschaftler des Instituts kamen der Bitte nach und entwickelten dabei eine nützliche neue Methode, die der Ermittlung illegaler ED-Medikamente dient.

Dazu hatte das Institut zuvor eine Screening-Methode für die zeitgleiche Bestimmung vieler Wirkstoffgruppen entwickelt, darunter auch PDE-5-Inhibitoren und ihre Metaboliten. Diese Methode wurde durch Verwendung von dotierten Blutproben und einer Quantifizierungsmethode unter Verwendung eines internen Standards entwickelt und umfassend validiert.

Bei dieser Methode basiert das Probenvorbereitungsverfahren auf einer schnellen und einfachen Flüssig-Flüssig-Extraktion (pH 9 mit Ethylacetat). Die Ermittlung unbekannter Substanzen gelang durch den Einsatz eines Shimadzu Nexera X2 Ultra-Hochleistungsflüssigkeitschromatographen (Ultra-High-Performance Liquid Chromatograph, UHPLC) in Kombination mit einem Shimadzu LCMS-8050 (QqQ) Tandem-Massenspektrometer.

Aufgrund der hohen Empfindlichkeit dieser Geräte konnte das Probenvolumen auf nur 200 µl reduziert werden. Für die Screening-Analyse der vom Gericht zur Verfügung gestellten Blutprobe wurde der Q3-Scan-Modus verwendet, während die Bestimmung der chemischen Verbindungen mittels Produktionen-Scan-Experimenten erfolgte. Vorläufer-Ionen wurden bei drei Kollisionsenergien fragmentiert (10, 20 und 35 V).

Die Ergebnisse dieser toxikologischen Analyse mit detaillierten chromatographischen und massenspektrometrischen Bedingungen sowie charakteristischen Fragmenten sind in den Abbildungen dargestellt. Fünf Analoga, die zur Gruppe der Phosphodiesterase-Inhibitoren gehören, darunter zwei Metaboliten, wurden mithilfe der oben genannten Methode identifiziert. Bei den nachgewiesenen Substanzen handelte es sich um Sildenafil und seine Metaboliten (N-Desmethylsildenafil und UK-331, 849) sowie um zwei synthetische Analoga von PDE-5-Inhibitoren (Isosildenafil und Homosildenafil), deren Vorhandensein im Blut darauf hindeuten kann, dass das Medikament von illegalen Akteuren hergestellt und/oder erworben wurde.

Die Gefahr, die mit Sildenafil-Analoga einhergeht, begründet sich im Mangel an Daten bezüglich Toxizität und Sicherheit. Da ihre Struktur der von legalen Phosphodiesterase-5-Inhibitoren wie Sildenafil ähnelt, können die Analoga tatsächlich auch ähnlich wirken. Andererseits weisen sie möglicherweise eine höhere oder geringere Wirksamkeit auf – die auf die Einnahme folgende Reaktion ist daher gänzlich unvorhersehbar. Durch diese mangelnde Vorhersehbarkeit und die Tatsache, dass Sildenafil, andere Phosphodiesterase-5-Inhibitoren und ihre Analoga in einer Reihe von weithin erhältlichen Produkten enthalten sein können, entsteht ein großer Bedarf an schnellen, einfachen und zuverlässigen Methoden zur Substanzermittlung.

Fazit

Durch die Adaption einer zuvor entwickelten Methode für biologische Analysen konnten die Wissenschaftler das Vorhandensein gefährlicher Substanzen – PDE-5-Analoga und deren Metaboliten – in nicht zugelassenen Medikamenten zur Behandlung von ED identifizieren und quantifizieren.

Die von ihnen entwickelte Methode bietet einen soliden reproduzierbaren Ansatz, der für Toxikologen und klinische oder analytische Chemiker von Interesse ist, die versuchen, neue, auf dem illegalen Arzneimittelmarkt auftauchende Substanzen aufzuspüren und nachzuweisen. Anhand dieser Methode wird die hohe Empfindlichkeit und Selektivität des Shimadzu Nexera X2 sowie die Tatsache sichtbar, dass Q1/Q3 dank seiner Hochgeschwindigkeits-MS/MS-Detektion in einem Scanning-Modus verwendet werden kann. Dies ist für diese Art von Detektor einzigartig. Darüber hinaus minimiert die Methode den Einsatz von biologischem Probenmaterial, so dass bei der Probenvorbereitung wesentlich geringere Mengen an organischen Lösungsmitteln benötigt werden.

Chromatographische und massenspektrometrische Bedingungen

Die Analysen wurden mit einem UHPLC-System, dem Shimadzu Nexera X2 (Kyoto, Japan), durchgeführt. Die Trennung erfolgte mit einer Kinetex XB-C18-Säule (150 x 2,1 mm Innendurchmesser, Partikelgröße 2,6 µm; Phenomenex, Torrance, CA, USA bei einer Säulentemperatur von 40 °C. Die mobile Phase bestand aus 0,1 % Ameisensäure in Wasser (A) und 0,1 % Ameisensäure in Acetonitril (B). Die Gradientenelution wurde mit einem konstanten Fluss von 0,4 ml/min durchgeführt. Folgender Gradient wurde verwendet: 0 min, 5 % B; 12 min, 98 % B; 14 min, 98 % B und 15 min, 5 % B. Die Rückkehr zur ursprünglichen Gradientenzusammensetzung (95 % A/5 % B) wurde 5 Minuten lang durchgeführt.

Der Nachweis der untersuchten Verbindungen wurde mit einem QqQ-MS/MS, Shimadzu LCMS-8050 (Kyoto, Japan), erbracht. Das Spektrometer war mit einer Elektrospray-Ionisationsquelle (ESI) ausgestattet; die Ermittlung der untersuchten Substanzen erfolgte im Produkt-Ionen-Scan-Modus. Die folgenden MS-Parameter wurden festgelegt: Nebulizing Gas, 3 l/min; Heating Gas, 10 l/min; Interface-Temperatur, 250 °C; Desolvation Line Temperatur, 200 °C; Heizblocktemperatur, 350 °C und Drying Gas, 10 l/min.

Es folgt eine detaillierte Verfahrensbeschreibung:

0,2 ml Blut wurden in 10-ml-Kunststoffröhrchen transferiert. Anschließend wurden 0,2 ml 0,5 M Ammoniumcarbonatpuffer (pH 9) hinzugefügt. Eine Flüssig-Flüssig-Extraktion mit 2 ml Ethylacetat wurde 10 Minuten lang ausgeführt. Die Proben wurden 10 Minuten lang bei 4 °C mit 2540 x g zentrifugiert. Die organische Phase wurde in 2-ml-Eppendorf-Röhrchen transferiert und bei 40 °C unter einem Strom von inertem Stickstoffgas bis zur Trocknung evaporiert. Die trockenen Rückstände wurden in 0,05 ml Methanol aufgelöst. Die Lösung wurde dann in Glaseinsätze von Autosampler-Vials transferiert und mittels Ultra-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie/Triple-Quadrupol-Tandem-Massenspektrometrie (UHPLC-QqQ-MS/MS) analysiert. Das Injektionsvolumen betrug 2,0 μl. Im Vergleich zu herkömmlichen Methoden verwenden wir nur geringe Mengen an umweltschädlichen organischen Lösungsmitteln und arbeiten mit einem kleinen biologischen Probenvolumen.

Der größte Vorteil dieser Methode besteht darin, dass sie nicht nur schnell und einfach, sondern auch selektiv und empfindlich ist und dank des Einsatzes von UHPLC-MS/MS die zeitgleiche Ermittlung unterschiedlicher PDE-5-Inhibitoren ermöglicht, sodass in forensischen Fällen charakteristische Fragmente in Produktionenspektren bei der Identifizierung solcher Substanzen hilfreich sein können.