Die Komplettlösung für die Cannabis-Analytik
Von der Probenvorbereitung bis zum analytischen Ergebnis
Uwe Oppermann, Shimadzu Europa GmbH
Dr. Tanja Butt, Retsch GmbH
Ulf Sengutta, CEM GmbH
Die Vor- und Nachteile des Cannabiskonsums werden in Deutschland aufgrund der 2024 erfolgten Legalisierung des Eigenanbaus wieder einmal heiß diskutiert. Bereits seit ein paar Jahren erlaubt sind ärztliche Verschreibungen von Medizinalcannabis (Blüten und Extrakten), außerdem der Verkauf von aus sogenanntem Nutzhanf hergestellten Lebensmitteln oder solchen mit Inhaltsstoffen des Nutzhanfs: Hanfsamen, -proteinpulver, -öle, -tees, -getränke oder auch CBD-Kaugummis und -Gummibärchen. Damit gesundheitliche Schäden durch Kontaminanten wie Pestizide, Mykotoxine und Schwermetalle ausgeschlossen werden können und keine Chargen mit zu hohem THC- oder CBD-Gehalt auf den Markt kommen, bedarf es einer zuverlässigen Analyse der Hanfpflanzen und/oder der daraus hergestellten Produkte. Cannabis anbauende Unternehmen, die Lebensmittelindustrie, Pharmafirmen – sie alle haben entweder eigene Labore oder beauftragen Experten mit der Cannabis-Analyse und -Qualitätskontrolle. Shimadzu bietet Laboren jetzt mit seinen Partnerfirmen Retsch und CEM Lösungspakete, die den kompletten Testvorgang – Zerkleinern, Aufbereiten, Analysieren – abdecken.
Es ist Spätsommer – der Beginn der Nutzhanfblüte. Für Landwirte, die „Western Cherry“, „Marina“, „Felice“ oder andere Hanfsorten anbauen, wird es bald Zeit, einen Teil der Blüten und Blätter im Labor untersuchen zu lassen. Schließlich wünschen sich ihre Kunden – Hersteller von Hanfproteinpulvern, Hanfölen, Hanftees oder CBD-Gummibärchen und -Gels – ein Naturprodukt von höchster Qualität. Pestizide, Pilze und Schwermetalle will niemand zu sich nehmen, wenn er einen CBD-Kaugummi kaut. Cannabislabore ermitteln aber nicht nur den Anteil der Kontaminanten, sondern auch den der Wirkstoffe. Der Gehalt von zum Beispiel CBD und THC schwankt von Jahr zu Jahr und von Feld zu Feld und muss stichprobenartig gemessen werden, denn die verschiedenen Endprodukte haben unterschiedliche gesetzlich erlaubte Höchstwerte für Wirkstoffe aus der Cannabispflanze.
Hat Landwirt Müller oder Huber seine ausgewählten Hanfpflanzen eingeschickt, werden diese genauestens analysiert – in einem nicht ganz unkomplizierten Workflow, für den Shimadzu, Retsch und CEM aber jetzt ein vollständiges Lösungspaket bieten, das auch noch je nach Kundenanforderungen konfiguriert werden kann. Der folgende Beitrag erläutert die einzelnen Schritte der Wirkstoffanalyse („Potency Testing“) – von Homogenisierung über Extraktion bis Analytik – und geht zudem u. a. auf die Schwermetall- und Pestizidanalyse ein.
Potency Testing (Wirkstoffanalytik): CBD, CBDA, THC und THCA
Die Qualitätskontrolle von Cannabinoiden ist essenziell für die korrekte Kennzeichnung von Cannabisprodukten, sowohl für den medizinischen Bereich als auch für Lebensmittel. Die Wirksamkeit von Cannabis (Hanf) wird für gewöhnlich über den Gehalt von einigen ausgewählten Hauptcannabinoiden wie THCA, THC, CBD und CBN bestimmt, obwohl die Pflanze mehr als 500 einzigartige Verbindungen enthält, darunter über 80 chemische Alkaloide.
Schritt 1: Homogenisierung. Vor einer Analyse müssen Proben ausreichend homogenisiert werden, damit die spätere Analyse einer Probenteilmenge repräsentativ zur Ausgangsprobe und reproduzierbar ist. Die Vermahlung von Pflanzenteilen kann den Anwender jedoch vor zahlreiche Herausforderungen stellen, gerade wenn die Teile wie im Falle von Cannabis ölig und schwer zu homogenisieren sind. Hierbei steht Retsch mit seiner langjährigen Expertise beratend zur Seite: Die Auswahl der optimalen Labormühle, des Zubehörs sowie des gesamten Verfahrens richtet sich vor allem nach der Probenmenge, die zu vermahlen ist, sowie nach der Nachfolgeanalytik. Die zu vermahlende Probenmenge sollte groß genug sein, um die gesamte Probe zu repräsentieren; eine Probe von nur wenigen Gramm, sprich wenige Blütenblätter, könnte eine heterogene Probe wie Cannabisblüten nicht hinreichend repräsentieren.
Für das Potency Testing bietet sich die Verwendung der Schwingmühle MM 400 und eines besonderen Adapters an (Abbildung 2), mit dem bis zu acht Proben in konischen Zentrifugalröhren pro Mahldurchgang homogenisiert werden können. Hierzu werden die getrockneten Blüten bei –20 °C tiefgefroren und dann 4 g pro Röhrchen verwendet. Nach Zugabe von 2 x 15 mm Stahlmahlkugeln kann eine Homogenisierung bei 30 Hz für 3 Minuten erfolgen. Feinheiten von 1 bis 2 mm werden so erreicht. Diese Methode führt zu sehr reproduzierbaren Analysenwerten mit minimiertem Probenverlust für CBD, CBDA, THC und THCA und spart außerdem Zeit durch den hohen Probendurchsatz, die kurze Mahldauer und das Entfallen von Reinigungsaufwand für die Einweggefäße. Diese Methode ist auch zur Vermahlung von Proben für die Pestizidanalyse geeignet. Nach der Vermahlung kann eine Teilmenge von 500 mg für die nachfolgenden Schritte weiterverwendet werden.
Schritt 2: Extraktion. Bei der klassischen Soxhlet-Extraktion wird typischerweise für viele Stunden, meist bis zu 24 Stunden, eine Extraktion der CBD- und THC-haltigen Proben unter Rückfluss mit Lösemittelmengen von 250 bis 500 mL durchgeführt. Dieser einfache Arbeitsschritt kostet viel Zeit und verursacht hohe Kosten durch den Einsatz und die Entsorgung der großen Lösemittelmengen. Zudem ist der Platzbedarf für die Soxhlet-Apparaturen immens. Es werden komplette Abzüge benötigt und hinsichtlich der Nachhaltigkeit gilt es zu bedenken, dass Hunderte Liter Trinkwasser für die Rückflusskühlung der Soxhlet-Apparaturen eingesetzt werden. Demgegenüber gewinnen zeit- und kostensparende sowie nachhaltige Analyseverfahren sowohl in der Forschung wie auch in der Routineanalytik zunehmend an Bedeutung. Mit dem Lösemittel-Extraktionssystem EDGE werden Lösemittelextraktionen schnell, einfach, sicher und kostensparend durchgeführt.
Das EDGE von CEM ist eine ausgezeichnete Wahl für Laboratorien, die Cannabinoide (und Pestizide) aus Cannabis und seinen Produkten mit hohen Wiederfindungsraten und wiederholbaren Ergebnissen extrahieren müssen (Abbildung 3). Das EDGE ist ein automatisiertes, einfaches Extraktionssystem, das Lösungsmittel nutzt, um Proben schnell und effektiv zu extrahieren. Die Extraktionen im EDGE werden unter Druck bei definierten Temperaturen durchgeführt, was zu einer starken Beschleunigung der Reaktionskinetik führt.
Neben dieser schnelleren Desorption der Analyten von der flüssigen oder festen Matrix erfolgt das Aufheizen und Abkühlen der Probe durch ein spezielles Verfahren in wenigen Sekunden. 500 mg homogenisierte Probe werden in das Q-Cup eingefüllt und dieses wird in den Autosampler platziert. Der Greifarm befördert das Q-Cup in die Probenkammer, wo es dann automatisch druckdicht abgeschlossen wird. Nach Hinzufügen des Lösungsmittels wird die Zelle bei erhöhtem Druck auf eine definierte Temperatur schnell aufgeheizt und wenige Minuten lang bei konstanten Bedingungen gehalten, damit die Analyten aus der Probe dispersiv herausgelöst werden. Der Lösemittelextrakt wird durch die Q-Cup-Disk automatisch gefiltert, anschließend abgekühlt und ins Probenglas überführt.
Die beschleunigte Lösemittelextraktion ist erheblich schneller als Soxhlet, Ultraschall, klassische ASE, QuEChERS oder andere konventionelle Extraktionsmethoden und braucht dabei viel weniger Lösemittel bei gleichzeitig wesentlich geringerem Arbeitsaufwand. Der Platzbedarf des EDGE entspricht ca. einem DIN-A3-Blatt, das Gerät ist also sehr klein und kann praktisch überall aufgestellt werden, auch außerhalb eines Abzuges.
Schritt 3: Analytik. HPLC hat sich zum Goldstandard für schnelle und einfache Cannabinoid-Analytik entwickelt, da mit dieser Methode die Trennung und der Nachweis aller Cannabinoide erfolgen kann. Darüber hinaus bietet die HPLC-UV-Methode eine gute Linearität, eine niedrige Nachweisgrenze sowie eine hohe Präzision der Retentionszeit und der Peakfläche für die relevanten Cannabinoide (Abbildung 4).
Mit dem Cannabis Analyzer von Shimadzu (Abbildung 5) lassen sich alle elf wichtigen Cannabinoide bestimmen. Die Basis ist die Kompaktanlage i-Series Plus mit UV-Detektion. Die vorgefertigten Methoden machen den Schnelleinstieg in die Cannabis-Wirkstoffprüfung sehr einfach. Die i-Series Plus automatisiert die Probenvorbereitung, etwa die Probenverdünnung oder die Zugabe von Reagenzien. Das verringert das Risiko von Messfehlern durch manuelle Schritte und gewährleistet nicht nur bei der Analyse von Cannabis, pharmazeutischen Produkten und Lebensmitteln hochgradig reproduzierbare und zuverlässige Daten. Die i-Series Plus erfüllt durch spezielle Funktionen die Anforderungen an die Datenintegrität in der pharmazeutischen Industrie.
Terpenanalytik
Terpene sind organische Aromastoffe, die in den Trichomen (in denen THC produziert wird) gebildet werden und als wesentliche medizinische Kohlenwasserstoffkomponenten die homöopathische Gesamtwirkung beeinflussen. Ein sehr wichtiger Aspekt während der Vermahlung von Proben zur Terpenanalyse ist die Vermeidung von Erwärmung. Diese kann dazu führen, dass die Terpene als flüchtige Probenbestandteile verloren gehen, was die Ergebnisse der Nachfolgeanalytik verfälschen würde. Es konnte gezeigt werden, dass sich zur Analytik von Terpenen geschlossene Mahlsysteme wie Kugelmühlen besonders eignen (Abbildung 6). Zudem kann in diesen auch kryogen gearbeitet werden, was einen Verlust von flüchtigen Bestandteilen verhindert und gleichzeitig die Brucheigenschaften von öligen Proben so verbessert, dass eine gute Homogenisierung gelingt. In der CryoMill oder in der MM 500 control können max. 1 x 20 ml Probe bzw. 2 x 40 ml Probe innerhalb von wenigen Minuten mit flüssigem Stickstoff zuerst versprödet, dann vermahlen werden (Abbildung 7). Beide Systeme sind dabei besonders sicher und komfortabel, es gibt keine frei zugänglichen Bäder mit flüssigem Stickstoff, mit denen der Anwender in Kontakt kommen könnte. Die Kühlung erfolgt automatisiert. Programmierbare Kühlpausen sollten ausreichend lang gewählt werden, um eine Erwärmung wirklich zu unterbinden. In Kugelmühlen lassen sich Proben wie getrocknete Cannabisblüten auf 0,1 mm zerkleinern. Müssen größere Probenmengen bis ca. 4 Liter homogenisiert werden, kann dies auch in der Ultra-Zentrifugalmühle ZM 300 erfolgen (Abbildung 8). Hierbei wird durch einen optionalen Zyklon ein Luftstrom zur Kühlung der Probe generiert. Um eine Erwärmung möglichst gering zu halten, sollte nicht mit Ringsieben < 0,5 mm gearbeitet werden, eine Endfeinheit von ca. 300 µm ist üblich und ausreichend für eine gute Nachfolgeanalytik (Abbildung 6).
Die vermahlenen Proben können direkt analysiert werden. Die Charakterisierung der Terpene und ihrer synergistischen Wirkung mit den Cannabinoiden ist mit Shimadzu Gaschromatographie-Systemen (GC) leicht möglich und reicht von Kiefern- oder Pinienaromen bis hin zu Duftnoten frischer Zitrusfrüchte.
Das Shimadzu GCMS-TQ8050 NX (Abbildung 9) mit dem HS-20 Headspace Sampler und der NIST Spektrenbibliothek kann mehr als 3.000 Aromen und Duftstoffe identifizieren und erfüllt damit eine wichtige Voraussetzung zur Erstellung von Terpenprofilen, die als Qualitätskriterium für die Cannabispflanzen dienen. Die gleiche Systemkonfiguration kann für die Analyse von Restlösungsmitteln verwendet werden, während für die Pestizidanalytik ein zusätzlicher Flüssig-Autosampler eingesetzt wird.
Pestizidanalytik
Pestizide, die im kommerziellen Anbau von Cannabis verwendet werden, können krebserregend und erbgutverändernd sein und ernsthafte Gesundheitsprobleme verursachen, insbesondere bei immungeschwächten Konsumenten von medizinischen Cannabisprodukten. Aufgrund des Risikos einer Pestizidexposition durch inhalierte und konsumierte Cannabisprodukte müssen die Pestizide im Pflanzenmaterial und in daraus hergestellten Produkten überwacht werden. Zur Vermahlung und Homogenisierung eignen sich wiederum die in den vorherigen Abschnitten bereits genannten Mühlen. Prinzipiell lassen sich feiner vermahlene Proben besser extrahieren; daher sind hier wiederum die Kugelmühlen vorteilhaft.
Als Matrices haben sich Cannabis und seine verwandten Produkte als schwierig zu extrahieren erwiesen, und traditionellere Pestizidextraktionsmethoden wie QuEChERS haben gezeigt, dass sie mit diesen Produkten schlecht funktionieren. Daher ist eine bessere Extraktionsmethode erforderlich. Das EDGE von CEM (siehe Abschnitt Potency Testing und Abbildung 3) eignet sich hervorragend für die Pestizidanalytik. Das EDGE-Extraktionssystem wurde für die schnelle, automatisierte Lösemittelextraktion von Proben entwickelt. Damit werden unterschiedliche Proben schnell in nur 5 bis 10 Minuten extrahiert. Die Extraktionen im EDGE werden unter Druck bei definierten Temperaturen durchgeführt, was zu einer starken Beschleunigung der Reaktionskinetik führt. Neben dieser schnelleren Desorption der Analyten von der flüssigen oder festen Matrix erfolgt das Aufheizen und Abkühlen der Probe durch ein spezielles Verfahren in wenigen Sekunden.
Shimadzu bietet mit Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Systemen (LC-MS/MS) die empfindlichste und umfassendste Pestizidanalytik im europäischen Markt. So ist zum Beispiel eine hochempfindliche LC-MS/MS-Analyse von 211 Pestiziden in getrockneten Cannabisprodukten in weniger als 12 Minuten mit einem Shimadzu LCMS-8060 NX Triple-Quadrupole-Massenspektrometer (Abbildung 10) möglich.
Mykotoxine
Da Cannabis einen hohen Feuchtigkeitsgehalt hat, kann eine langfristige Lagerung zu Pilzwachstum führen, das als Schimmel bekannt ist und bei dem die Mykotoxine giftige Sekundärmetaboliten sind. Aflatoxine beispielsweise sind eine Untergruppe der Mykotoxine, die vorzugsweise in Böden und verrottender Vegetation vorkommen. In Europa hat die EU-Kommission strenge Richtlinien für die Probenahme- und Analysemethoden zur Kontrolle von Mykotoxinen festgelegt.
Ähnlich wie für die Probenvorbereitung für das Potency Testing können für die spätere Analyse von Mykotoxinen die Rotor- oder Kugelmühlen von Retsch verwendet werden, die Extraktion erfolgt leicht und schnell im Edge von CEM. Das LCMS-8050 Triple-Quadrupole-Massenspektrometer von Shimadzu ermöglicht es dem Cannabislabor, Mykotoxine schnell und mit hoher Empfindlichkeit im geforderten Konzentrationsbereich zu testen.
Schwermetallanalyse
Während ihres Wachstums können Cannabispflanzen giftige Schwermetalle wie Blei, Cadmium, Arsen und Quecksilber aus dem Boden aufnehmen. Sollen Proben auf Schwermetalle untersucht werden, eignet sich neben den bereits erwähnten Kugelmühlen und der ZM 300 auch die Messermühle GM 200, welche besonders einfach zu handhaben ist und Proben bis 200 ml in einem Durchgang homogenisiert. Es hat sich gezeigt, dass eine Korngröße von < 1-mm-Partikeln ausreicht, um eine sehr gute Reproduzierbarkeit zu erreichen. Die Standardabweichung lag für alle analysierten Elemente unter 5 %. Wird eine kürzere Mahldauer gewählt, die in gröberen Partikeln (2 mm) resultiert, so ist mit Standardabweichungen bis 12 % zu rechnen (Abbildung 11). Eine entsprechende Sorgfalt in der Homogenisierung zahlt sich daher aus, um solche Partikelgrößeneffekte zu minimieren.
Besonderes Augenmerk muss bei der Zerkleinerung im Falle einer Schwermetallanalytik auf die Wahl der richtigen Mahlwerkzeuge gelegt werden. Da eine mechanische Zerkleinerung immer mit Abrieb des Zerkleinerungswerkzeuges verbunden ist, kommt es bei Verwendung von Stahlwerkzeugen unweigerlich zu einer Verfälschung (Erhöhung) der Schwermetallwerte in der Probe. Dies kann mit der richtigen Auswahl der Mahlwerkzeuge umgangen werden, beispielsweise mit Werkzeugen aus Zirkonoxid im Falle von Kugelmühlen oder Titan im Falle der GM 200 oder der ZM 300. In Abbildung 12 ist deutlich zu erkennen, dass Stahlwerkzeuge die gemessene Konzentration an Schwermetallen erhöhen und verfälschen.
Es gibt verschiedene Methoden zur Bestimmung von Spurenmetallen in Pflanzenmaterial wie Cannabis oder in Edibles (mit Hanf versetzten Lebensmitteln). Alle erfordern einen Mineralsäureaufschluss, um die organische Matrix zu zerstören, Metallspuren zu lösen und so eine flüssige Probe zu erhalten. Hierzu eignet sich das MARS 6 von CEM (Abbildung 13). Es ist das einzige System, das integrierte Sensortechnologie verwendet, um den Gefäßtyp sowie die Probennummer zu erkennen und daraus einen benutzerdefinierten Algorithmus zu erstellen, der die höchste Qualität des Extraktes gewährleistet.
Mit Optionen für die Fernsteuerung des Systems und der berührungslosen Temperaturregelung aller Behälter ist das MARS 6 in der Lage, auch schwierigste Proben zu verarbeiten. „Mikrowellenschlusssysteme“ sind im Gegensatz zu Aufschlusssystemen mit konvektiver Beheizung in der Lage, innerhalb von kurzer Zeit die Feststoffprobe zu lösen. Da sich die Aufschlusszeiten mithilfe der Mikrowellenenergie oft um ein Vielfaches verringern, bedeutet dies gerade für den Routinebetrieb einen nicht unerheblichen Zeitgewinn und damit auch Kosteneinsparung. Nahezu jedes Probenmaterial lässt sich mit Mikrowellenenergie schneller aufschließen als mit herkömmlichen Methoden.
Für den Mikrowellenaufschluss werden 0,5 g Cannabisprobe zusammen mit 9 ml HNO3 und 1 ml HCl in ein MARSXpress-Plus-Gefäß gegeben. Nach Beendigung der anfänglichen Reaktionen werden die Gefäße verschlossen und in den Rotor gegeben, der bis zu 24 Proben in einem einzigen Lauf temperaturkontrolliert aufschließen kann. Nachdem der Rotor/Drehteller mit den Probengefäßen ins MARS 6 eingesetzt wurde, startet man die vorprogrammierte „Cannabismethode“ mittels One-Touch-Technik auf dem Touchscreen des MARS 6. Das MARS 6 erkennt alle relevanten Aufschlussparameter von selbst, sodass nach nur einem Knopfdruck auf die „One Touch“-App der Aufschluss automatisch erfolgt. Dies beinhaltet die Steuerung der Reaktionsparameter Zeit, Druck und Temperatur, das Zählen der Behälter, die optimale Mikrowellenleistung und den Behältertyp. Außerdem werden die Temperaturen sämtlicher Behälter auf dem Touchscreen des MARS 6 visuell dargestellt. Die neuartige Sensortechnik kontrolliert direkt die Reaktionskinetik der Aufschlussreaktionen und regelt daraufhin die optimale Mikrowelleneinwirkung.
Schwermetalle wie Arsen, Cadmium, Chrom und Blei sind natürliche Bestandteile der Erdkruste und kommen typischerweise in unserer Umwelt und damit im Wasser und in den Böden in unterschiedlichen Konzentrationen vor. Die Konzentration von Schwermetallen in Pflanzen, die für den Verzehr bestimmt sind, muss aufgrund der potenziell gefährlichen Toxizität sorgfältig kontrolliert werden. Cannabis im Besonderen ist eine Pflanze, die dem Boden Schwermetalle entzieht, die dann in der Pflanze angereichert werden.
Das Shimadzu Massenspektrometer ICPMS-2050 mit induktiv gekoppeltem Plasma (Abbildung 14) und seiner neu entwickelten Kollisionszelle zur Minimierung von Interferenzen bietet die erforderliche Empfindlichkeit, um geringste Konzentrationen dieser toxischen Metalle mit hoher Genauigkeit zu messen.
Alle Werkzeuge für die Qualitätskontrolle
Drei Partner, eine Komplettlösung: Der jetzt vorliegende analytische Werkzeugkasten beinhaltet unterschiedliche Systemkonfigurationen, angefangen bei der unabdingbaren analysengerechten Probenvorbereitung mit verschiedenen Labormühlen von Retsch (Kugel-, Rotor-, Messer- oder Schneidmühlen) über Probenaufschlüsse mit Mikrowellen-Laborgeräten und mikrowellenbeschleunigten Lösungsmittel-Extraktionssystemen von CEM (MARS 6 und EDGE) bis hin zur instrumentellen Analytik. Hier bietet Shimadzu den HPLC Cannabis Analyzer für Wirkstoffanalytik, das LCMS-8060NX Triple-Quadrupol-Massenspektrometer für Pestizid- und Mykotoxin-Analytik, das Triple-Quadrupol-Massenspektrometer TQ-8050 NX für Terpenanalytik und das ICPMS-2050 für die Bestimmung von Schwermetallen. Mit diesem Werkzeugkasten können Cannabislabore und Hersteller mit eigenem Labor effizient und in voller Übereinstimmung mit den internationalen Vorschriften arbeiten. Für eine repräsentative und reproduzierbare Analyse sollte eine entsprechende Sorgfalt bei allen drei Teilbereichen, die durch die oben genannten Firmen abgedeckt werden, Anspruch sein.
Fallen dann auch noch die Messergebnisse positiv aus, steht dem Zertifikat für Landwirt Müller oder Huber nichts mehr im Wege – dann kann der Nutzhanf weiterverarbeitet werden und landet in Form eines Öls oder Tees vielleicht schon bald in Ihrem Supermarkt um die Ecke.
