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Kein Grund zur Skepsis

Die neuen Shim-pack Scepter-Säulen für LC/LCMS sind robust und äußerst pH-stabil

Dr. Carola Thiering, Shimadzu Europa GmbH

Die neuen Shim-pack Scepter-Säulen mit Hybridmaterialien vereinen die Vorteile von silika- sowie polymerbasierten Säulen: sie sind effizient, druckstabil und tolerieren weite pH-Bereiche. Zudem gibt es sie als metallfreie Varianten für sensitive LC/MS-Messungen von biologischen Proben oder chelatisierenden Substanzen.

»Die Trennsäule ist ein High-Tech-Produkt und nicht eine Röhre, die mit Schlamm gefüllt ist.«

Klaus K. Unger, Stefan Lamotte: „Chromatographie: Trennsäulen in der analytischen HPLC“ [1]

»Die Trennsäule ist ein High-Tech-Produkt und nicht eine Röhre, die mit Schlamm gefüllt ist.«
Klaus K. Unger, Stefan Lamotte: „Chromatographie: Trennsäulen in der analytischen HPLC“ [1]

Vielmehr ist sie das Herzstück einer Analyse, zusammen mit dem Eluenten, und je nach Analyseziel bieten sich spezifische Säulen an. In ihrem Aufbau und ihrer Packung fließen interdisziplinäres Wissen zusammen; ihre Selektivität beispielsweise hängt von zahlreichen Material- und Verfahrensparametern ab.

Um ein optimales Leistungszusammenspiel aller Teile einer HPLC-Anlage zu unterstützen, spielen nahtlose Qualitäts- und Transportketten besonders in High-Tech-Anwendungen eine wichtige Rolle. Die Nutzer profitieren dabei von einer Zulieferung aus einer Hand und den aufeinander abgestimmten Komponenten und Prozessen. Daher sind Zubehöre und Consumables ein integraler Bestandteil einer Komplettlösung von Shimadzu.

Mit einer neuen Serie von LC-Säulen erhalten die Anwender ein Mehr an Flexibilität. Die neuen Säulen aus der Shim-pack Scepter-Serie sind mit Hybridmaterialien gepackt und als Metall- sowie metallfreie Varianten erhältlich. Sie ergänzen das silika-basierte, Core-Shell- und Polymersäulen-Sortiment und decken eine größere Menge an Applikationswünschen als zuvor ab. Die wesentlichen Vorteile von Hybridmaterialien sind ihre pH-Stabilität und Robustheit. Außerdem sind sie in vielen verschiedenen Partikelgrößen sowie Dimensionen verfügbar und somit zwischen UHPLC, HPLC und präparativer LC skalierbar.

Organo-Silika-Hybrid-Säulen

Aber wie genau kann man sich eigentlich Organo-Silika-Hybridmaterial vorstellen? Die Partikel sind organisch/anorganische silika-basierte Hybridmaterialien, oder anders ausgedrückt: sie basieren auf Hybrid-Silika-Gel (Abbildung 1), für deren Produktion Tetraethoxysilan und 1,2-bis(triethoxysilyl)ethan als Edukte verwendet werden.

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Abbildung 1: Herstellung und Aufbau des Hybrid-Silika-Gels [1]
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Abbildung 1: Herstellung und Aufbau des Hybrid-Silika-Gels [1]

Das entstandene Hybridmaterial ist schematisch gezeigt. Dabei stellt die obere Schicht die Oberfläche dar und die untere die interne Struktur des Partikels. Es wird deutlich, dass die Siliziumatome nicht nur durch ein Sauerstoffatom verbunden sind, sondern teilweise auch durch eine Ethylenbrücke. Durch diese Kombination von Silikagel mit Organikanteilen wird das Material sehr robust und pH-stabil.

Auch die Silanolgruppen an der Oberfläche werden zum Teil durch eine Ethylenbrücke ersetzt. Die hierdurch erreichte Abnahme der Silanol-Gruppen an der Oberfläche ist maßgeblich für die Erhöhung der Stabilität und Inertheit des Kieselgels verantwortlich, da es gegenüber chemischen Angriffen abgeschirmt ist.

Dadurch sind die Hybridmaterialien vielseitig für die HPLC einsetzbar. Vorteile sind

  • eine hohe Lebensdauer, sogar unter harschen Bedingungen wie einem hohen pH-Wert oder einer hohen Temperatur
  • generell eine hohe chemische und physikalische Beständigkeit
  • eine gute Peakform für alle Arten von Verbindungen und
  • Reproduzierbarkeit.

Die Selektivität ist auch über verschiedene Partikelgrößen gleich, daher ist der Methodentransfer zwischen UHPLC und HPLC sehr einfach. Durch die präparativen Säulen im Portfolio ist der Methodentransfer sogar auf die präparative LC übertragbar.

Leichter Methodentransfer; sensitive Messungen

Säulen mit Hybridmaterialien vereinen die Vorteile von silika-basierten und von polymerbasierten Säulen: Sie sind effizient und druckstabil, aufgrund ihrer mechanische Stabilität. Zudem weisen sie eine hohe Toleranz gegenüber basischen, mobilen Phasen auf und eine geringe Silanol-Azidität. [1]

Ein weiterer Vorteil ist, dass es das Scepter-Portfolio auch mit metallfreien Varianten gibt, die sehr effektiv für sensitive LC/MS-Messungen von chelatisierenden Substanzen sind, die ansonsten starkes Tailing zeigen würden. Also kein Grund zur Skepsis – denn insgesamt bilden die Shim-pack Scepter-Säulen ein großes Sortiment und sind durch das Hybridmaterial äußerst robust und langlebig.

Shim-pack Scepter-Portfolio: für zahlreiche Applikationen mit diversen Substanzen

Das Scepter-Portfolio deckt verschiedenste stationäre Phasen und Dimensionen ab. Zu jeder stationären Phase gibt es außerdem eine passende Vorsäule mit Halter. In Abbildung 1 sind alle Phasen mit den jeweiligen Spezifikationen gezeigt. Besonders erwähnenswert sind mit 30 nm die große Porengröße der Scepter-C4-Säule, ideal für die Analyse von Proteinen oder Antikörpern, sowie der weite pH-Bereich von 1-12 für die Scepter C18, HD-C18 und C8.

Shim-pack Scepter Umgekehrte Phase HILIC
C18 HD-C18 C8 C4 Phenyl PFPP Diol-HILIC
Ligandentyp Trifunktional C18 Trifunktional C18 Trifunktional C8 Trifunktional C4 Trifunktional Phenylbutyl Trifunktional Penta­fluoro­phenyl­propyl Trifunktional Dihydroxypropyl
Allgemeiner Standard Typ Typ mit hoher Belegungsdichte
Partikel Organic Silica Hybrid
Partikelgröße 1,9 µm, 3 µm, 5 µm
Porengröße 12 nm 8 nm 12 nm 30 nm 12 nm
Endcapping Proprietär Keine
pH Bereich 1 – 12 1 – 10 1 – 8 2 – 10
100% wässriger Zustand Ja Nein Nein Ja Ja Ja N/A
USP Klassifizierung L1 L1 L7 L26 L11 L43 L20
Tabelle 1: Die verschiedenen stationären Phasen der Shim-pack Scepter Serie mit den jeweiligen Spezifikationen
Shim-pack Scepter Umgekehrte Phase HILIC
C18 HD-C18 C8 C4 Phenyl PFPP Diol-HILIC
Ligandentyp Trifunktional C18 Trifunktional C18 Trifunktional C8 Trifunktional C4 Trifunktional Phenylbutyl Trifunktional Penta­fluoro­phenyl­propyl Trifunktional Dihydroxypropyl
Allgemeiner Standard Typ Typ mit hoher Belegungsdichte
Partikel Organic Silica Hybrid
Partikelgröße 1,9 µm, 3 µm, 5 µm
Porengröße 12 nm 8 nm 12 nm 30 nm 12 nm
Endcapping Proprietär Keine
pH Bereich 1 – 12 1 – 10 1 – 8 2 – 10
100% wässriger Zustand Ja Nein Nein Ja Ja Ja N/A
USP Klassifizierung L1 L1 L7 L26 L11 L43 L20
Tabelle 1: Die verschiedenen stationären Phasen der Shim-pack Scepter Serie mit den jeweiligen Spezifikationen

Im Folgenden werden die verschiedenen stationären Phasen dargestellt und die wichtigsten Eigenschaften kurz erläutert:

Shim-pack Scepter C18: für Substanzen mit mittlerer bis hoher Hydrophobizität

Diese Phase ist die Standardwahl für Umkehrphasen-Chromatographie. Die Scepter C18 weist die höchste hydrophobe Retention im Sortiment auf. Sie eignet sich für Substanzen mit mittlerer bis hoher Hydrophobizität. Die Dichte der C18-Ketten auf der Oberfläche der Organosilika-Hybrid-Partikel ist geringer im Vergleich zu der Scepter HD-C18 (Abbildung 2 und 3).

Abbildung 2: Schematische Darstellung der Scepter C18
Abbildung 3: Schematische Darstellung der Scepter HD-C18

Shim-pack Scepter HD-C18: für Moleküle mit geringen strukturellen Unterschieden

Die HD-C18 Phase ist bestens geeignet, stark hydrophobe, kleine Moleküle mit geringen strukturellen Unterschieden zu trennen – zum Beispiel Isomere. Die Dichte der C18-Ketten auf der Oberfläche der Organosilika-Hybrid-Partikel ist höher im Vergleich zu der Scepter HD-C18 (Abbildung 2 und 3). Dadurch erfahren Moleküle, die aufgrund ihrer Größe zwischen die C18-Ketten gelangen können, mehr Wechselwirkungen als Moleküle, die mit ihrer molekularen Struktur nicht oder nur zum Teil dazwischen gelangen. Somit lassen sich Moleküle mit geringen strukturellen Unterschieden besser auftrennen.

Shim-pack Scepter C8

Diese Phase eignet sich für Substanzen, die auf der C18-Säule zu stark retardiert werden.

Shim-pack Scepter C4: für Substanzen mit mittlerer bis hoher Hydrophobizität

Diese neueste Säule im Shim-pack Scepter-Sortiment hat mit 30 nm sehr große Poren und ist daher optimal geeignet für biologische Proben wie Proteine und monoklonale Antikörper. Proteine können mit dieser C4-Phase bis zu einem Molekulargewicht von 150.000 Dalton analysiert werden. Gerade für die Analyse von Antikörpern ist die Stabilität der Säule auch unter sauren Bedingungen sowie hohen Temperaturen gegeben.
Zusätzlich zu diesen Vorteilen trennt die C4 Phase effektiver sehr hydrophobe Substanzen, die mit der regulären C18 Säule schwierig zu trennen sind.

Shim-pack Scepter Phenyl: für aromatische, konjugierte Verbindungen

Eignet sich bestens für aromatische, konjugierte Verbindungen, da die Phenylgruppe mit п-Elektronen von den Substanzen interagiert.

Shim-pack Scepter PFPP

Die Abkürzung PFPP bedeutet Pentafluorophenylpropyl. Diese Gruppe sorgt für eine alternative Selektivität für Konformationsisomere (cis/trans) und polare sowie halogenierte Verbindungen. Außerdem werden geladene Basen stärker retardiert.

Shim-pack Scepter Diol-HILIC: für polare Analyten

Mit der Diol-HILIC (Hydrophile Interaktionschromatographie) können polare Analyten retardiert werden. Die chemische Zusammensetzung der stationären Phase ist reines Silika. Die MS-Sensitivität wird erhöht, beispielsweise durch den hohen Anteil an Organik, der im HILIC-Modus verwendet werden kann.

Alle Säulen sind robust innerhalb eines weiten pH-Bereichs. In den Chromatogrammen in Abbildung 4 (Messparameter und Methoden werden im Folgenden erläutert) wird die Stabilität deutlich. Die Ergebnisse der Analysen auf den verschiedenen, stationären Phasen sind dort bei verschiedenen pH-Werten (2,9; 6,1 und 9,9) gezeigt.

Abbildung 4: Die Shim-pack Scepter-Säulen bieten eine hohe Stabilität, auch unter niedrigen sowie hohen pH-Werten. Peaks: 1: Saccharin (pKa = 2,2), 2: Dextrometorphan (pKa = 8,3), 3: Amitryptilin (pKa = 9,4), 4: n-Butylparaben (pKa = 8,3), 5: Ibuprofen (pKa = 4,4).

Da hier dieselbe Methode für alle Phasen bei verschiedenen pH-Werten verwendet wird, sind nicht immer alle Substanzen optimal voneinander getrennt. Bei den Chromatogrammen, die mit dem roten Kreis markiert sind, sind alle Substanzen voneinander getrennt. Die Chromatogramme mit dem blauen X weisen coeluierende oder nicht bestimmbare Peaks auf. Insgesamt wird deutlich, dass die Säulen eine hohe Stabilität bei verschiedenen pH-Bereichen zeigen und dennoch eine sehr gute Trennleistung haben.

Auch die verschiedenen Retentionsmechanismen werden in Abbildung 4 deutlich: Die HD-C18 zeigt bei kritischen Substanzen eine bessere Trennleistung als die C18. Die C8-Phase zeigt wie erwartet weniger Retention als die C18-Phasen, wohingegen die Phenyl- wie auch die PFPP-Phase ganz andere Trennmechanismen haben, wodurch sich hier teilweise die Retention umkehrt bzw. stark verschiebt. Zusammenfassend bietet das Shim-pack Scepter-Portfolio die passende Säule für zahlreiche Applikationen mit verschiedensten Substanzen.

Messparameter und Methoden

Säulen:Shim-pack Scepter (50 mm x 2,0 mm I.D., 5 µm)
Mobile Phase:0,1 min: 95 % H2O, 5 % ACN → 10 min: 10 % H2O, 90 % ACN
10-15 min: 10 % H2O; 90 % ACN
Ofentemperatur:25 °C
Flussrate:0,2 ml/min
Detektion:230 nm

Metallfreie Säulen im Sortiment

Die verschiedenen Säulen des Shim-pack Scepter-Portfolios sind auch metallfrei erhältlich und runden das Angebot ab. Es umfasst an metallfreien Säulen nicht nur die auf silikagel-basierte G-Serie, sondern auch die organosilikahybrid-basierte Scepter-Serie.

Den schematischen Aufbau der metallfreien Säulen zeugt Abbildung 5. Dort ist gut zu erkennen, dass die Partikel als Füllmaterial nicht direkt mit dem Edelstahlkörper in Kontakt kommen, da dieser mit einer Schicht aus Polyetheretherketon (PEEK) ummantelt ist. Sie betrifft auch die Verbindungsstücke der Säule, sodass die zu untersuchende Probe nicht mit Edelstahl in Kontakt kommt.

Abbildung 5: Schematischer Aufbau der metallfreien Shim-pack Scepter-Säulen

Gerade bei biologischen und chelatisierenden Proben ist dies ein großer Vorteil. Sie wechselwirken mit Metall und würden deshalb ohne PEEK-Ummantelung keine symmetrische Peakform und starkes Tailing zeigen, oder sogar eine Abnahme der Signalintensität durch Adsorption. Die Kombination aus Edelstahlkörper und PEEK-Ummantelung ist hierbei sehr gut: Der Edelstahlkörper ist stabil und bietet der Säule so eine hohe Druckstabilität, wohingegen die PEEK-Ummantelung die benötigte Inertheit mitbringt. Die metallfreien Säulen sind auch für LCMS-Analysen sehr gut geeignet und zeigen dort eine hohe Intensität.

Anwendung

Wann ist es sinnvoll, in eine HPLC-Säule mit Hybridmaterial wie die Shim-pack Scepter zu investieren? Wie so oft richtet sich dies nach der Applikation. Die Scepter-Serie zeigt vor allem ihre Vorteile, wenn während der HPLC-Analyse harsche Bedingungen herrschen. Sie bietet Stabilität auch bei einem hohen pH-Wert und hohen Temperaturen. Auch für Methodenentwicklung oder Methodenskalierung zwischen UHPLC, HPLC und präparative LC sind die Scepter-Säulen bestens geeignet, da sie in vielen Dimensionen und Partikelgrößen verfügbar sind und dabei die gleiche Trennleistung liefern.

Literatur