Auf die Säule kommt es an
Shim-Pack-Säulen ermöglichen es, schwierig zu trennende Substanzen aufzutrennen
Timofey N. Komarov, Igor E. Shohin, Margarita A. Tokareva, Olga A. Archakova, Dana S. Bogdanova, Alexandra A. Aleshina, Natalia S. Bagaeva, Veronika V. Davydanova – Center of Pharmaceutical Analytics LLC, 117246, Russia, Moscow
Die Entwicklung neuer Medikamente erfordert auch, neue analytische Methoden zu finden, um Therapien zu überwachen sowie den Weg eines Arzneimittels zu kontrollieren, wie es in den Körper gelangt, dort aufgenommen und verdaut wird, die so genannte Pharmakokinetik. Die Methoden müssen arbeits- und kosteneffizient sein. Dabei kommt es auch auf das Zusammenspiel der einzelnen Komponenten eines Analysesystems an, also etwa dem Chromatograph und der optimalen Säule.
Die HPLC mit zahlreichen Nachweismethoden wird wirksam eingesetzt, um den Arzneimittelgehalt in biologischen Flüssigkeiten zu bestimmen. Eine der schwierigsten Aufgaben in der Praxis ist die chromatographische Trennung von unzureichend zurückgehaltenen Verbindungen, wie es etwa bei Arzneimittelwirkstoffen auf einer Chromatographiesäule der Fall ist. Valganciclovir und Ganciclovir sind Beispiele für derartige Wirkstoffe; beide werden gegen Herpesviren eingesetzt – Ganciclovir als Infusion und Valganciclovir in verschiedener Darreichungsform.
Das Ziel dieser Studie bestand in der Entwicklung eines LC-MS/MS-Verfahrens, um Valganciclovir und Ganciclovir im menschlichen Plasma zu bestimmen; das dient pharmakokinetischen Untersuchungen und der Medikamentenspiegelbestimmung (TDM – Therapeutisches Drug Monitoring). Diese Methode wurde entwickelt und validiert. Linearität in Plasmaproben wurde im Konzentrationsbereich 5-1.000 ng/ml für Valganciclovir und 50-10.000 ng/ml für Ganciclovir erreicht.
Die HPLC als moderne Analysetechnik ist weit verbreitet zur Bestimmung des Medikamentengehalts in biologischen Flüssigkeiten. Abhängig von den chromatographischen Bedingungen und dem verwendeten Detektor ist es möglich, Substanzen mit unterschiedlichen Eigenschaften zu trennen und zu identifizieren – insbesondere auch Substanzen mit ähnlicher Struktur.
Herausforderung: Trennung von Arzneimitteln
Eine der herausforderndsten Aufgaben in der Praxis ist es, Arzneimittel aufzutrennen, die auf einer klassischen RP-Chromatographiesäule wenig zurückgehalten werden. Zahlreiche chromatographische Verfahren lassen sich für diesen Zweck einsetzen, wie HILIC (hydrophile Interaktions-Chromatographie) und Ionenaustausch-Säulen oder Ionenpaar-Reagenzien als Elutionsmittel. Diese Herangehensweisen können sich aber als ineffektiv erweisen, wenn ein Massenspektrometer als Detektor genutzt wird, oder wenn die Arzneimittelmessungen in komplexen biologischen Matrizes erfolgen. Der Fall Valganciclovir (VAL, Abbildung 1) und Ganciclovir (GAN, Abbildung 2) verdeutlicht diese Situation.
Ursprünglich als Medikament zur Behandlung einer Zytomegalievirus-Infektion entwickelt, wurde bald entdeckt, dass Ganciclovir in vitro andere Herpesviren hemmen konnte (menschliche Herpesviren vom Typ 1 und 2, Epstein-Barr-Viren, Windpockenviren, menschliches Herpesvirus Typ 6 etc.). [1] Normalerweise wurde Ganciclovir intravenös nur im Verlauf der Therapie verabreicht. Mit dem neuen Vorläufermedikament namens Valganciclovir gelang es, die Bioverfügbarkeit zu steigern. Valganciclovir metabolisiert leicht zu Ganciclovir, das dann therapeutisch wirksam wird. [2, 3]
Wie viele andere antivirale Medikamente sind Valganciclovir und Ganciclovir verhältnismäßig hydrophile Substanzen, was an ihren Octanol/Wasser-Verteilungskoeffizienten (log P) deutlich erkennbar ist (Tabelle 1).
| Valganciclovir | Ganciclovir | Acyclovir (interner Standard, IS) | |
| Log P | -0,81 | -1,66 | -0,95 |
| pKa | 10,16 | 8,71 | 11,98 |
| Referenz | [4] | [5] | [6] |
Diese Eigenschaften müssen bei der Entwicklung einer Analysemethode inklusive Probenaufbereitung und Trenntechnik berücksichtigt werden.
Die bisherigen Analyseverfahren nutzten die HPLC mit UV-Detektion [7, 8, 9] und mit einem Massenspektrometer gekoppelt. [10] Beide Verfahren waren nicht in der Lage, Valganciclovir und Ganciclovir simultan zu messen, sondern jeweils nur eine der Verbindungen.
Optimale Trennung der Substanzen mit MS-Nachweis
Die Autoren dieser Veröffentlichung versuchten, ein Verfahren zur simultanen GAN- und VAL-Bestimmung mit Hilfe der HPLC-UV zu entwickeln. Aber diese Methode benötigte den Einsatz der speziellen Chromatographie-Säule „YMC-Pack Polyamine II“ und die Einstellung des Eluentenstroms auf 2 ml/min, was den Verbrauch an Reagenzien deutlich erhöhte. Darüber hinaus war eine recht lange Analysedauer (etwa 26 Minuten) erforderlich, um eine optimale Trennung der Substanzen und des internen Standards zu erzielen.
Die Kombination von MS-Detektion und der chromatographischen Auftrennung ermöglicht eine Verminderung der Flussrate und eine signifikante Verkürzung der Analysendauer. Diese Untersuchung zeigt Entwicklung und Validierung der Nachweismethoden von Valganciclovir und Ganciclovir im menschlichen Blutplasma mit Hilfe der LC-MS/MS.
Materialien und Methoden
Ein UHPLC Nexera XR gekoppelt mit einem LCMS-8040-Tandemmassenspektrometer (beide von Shimadzu) wurden verwendet. Methanol (UHPLC-Grade) wurde von J. T. Backer bezogen, Acetonitril (LCMS-Grade) von Biosolve, Ameisensäure (rein 98 %) und wässrige Ammoniaklösung (Grade „für Analyse“) von PanReac. Deionisiertes Wasser wurde über ein „Milli-Q“-System von Millipore hergestellt. Valganciclovirhydrochlorid (USP Referenzstandard, 99,2 %), Ganciclovir (USP Referenzstandard, 97,5 %) und als interner Standard Acyclovir (ACI; USP Referenzstandard, 94,6 %) wurden eingesetzt, um Stammlösungen durch Auflösen in Methanol anzusetzen. Gemischte GAN- und VAL-Arbeitslösungen und eine ACI-Arbeitslösung wurden durch Verdünnung der Stammlösungen auf die benötigten Plasmakonzentrationen (Tabelle 2) mit gleichem Lösungsmittel hergestellt. Stamm- und Arbeitslösungen sowie intakte Blutplasmaproben wurden bis zur Verwendung tiefgekühlt bei -45 oC aufbewahrt.
| Level | Analytkonzentration, ng/ml | IS Konzentration, ng/ml | |
| VAL | GAL | ACI | |
| 1 | 5,00 | 50,00 | 1000,00 |
| 2 | 10,00 | 100,00 | 1000,00 |
| 3 | 25,00 | 250,00 | 1000,00 |
| 4 | 50,00 | 500,00 | 1000,00 |
| 5 | 100,00 | 1000,00 | 1000,00 |
| 6 | 250,00 | 2500,00 | 1000,00 |
| 7 | 400,00 | 4000,00 | 1000,00 |
| 8 | 750,00 | 7500,00 | 1000,00 |
| 9 | 1000,00 | 10000,00 | 1000,00 |
| LLOQ | 5,00 | 50,00 | 1000,00 |
| L | 15,00 | 150,00 | 1000,00 |
| M | 500,00 | 5000,00 | 1000,00 |
| H | 800,00 | 8000,00 | 1000,00 |
Probenaufbereitung
10 μl Acyclovir-Arbeitslösung wurden zu 200 μl einer Kalibrationsprobe in ein 2 ml Eppendorf Zentrifugenröhrchen zugefügt, anschließend 600 μl Acetonitril zugegeben, für 10 Sekunden gevortext, dann 15 min lang bei 13.500 rpm zentrifugiert. Der sich ergebende Überstand wurde in Fläschchen überführt und in einen Autosampler gegeben.
HPLC-Bedingungen
| Säule: | Shim-Pack GWS C18 (5 µm; 150 x 4,6 mm) |
| Säulentemperatur: | 40 °C |
| Mobile Phase (A): | 0,1 % Ameisensäure in Wasser mit 0,08 % Ammoniak (v/v) |
| Mobile Phase (B): | 0,1 % Ameisensäure, 10 % Wasser in Acetonitril mit 0,08 % Ammoniak (v/v) |
| Gradient: | Der Gradient ist aus Tabelle 3 ersichtlich |
| Injektionsvolumen: | 5 μl |
| Zeit, Min. | Mobile Phase A, % | Mobile Phase B, % | Durchflussrate, ml/min |
| 0,00 | 85,00 | 15,00 | 1,00 |
| 0,70 | 85,00 | 15,00 | |
| 3,50 | 90,00 | 10,00 | |
| 4,00 | 0,00 | 100,00 | |
| 5,50 | 0,00 | 100,00 | |
| 5,70 | 85,00 | 15,00 | |
| 7,00 | 85,00 | 15,00 |
MS-Bedingungen
| Ionisierung: | ESI, positiv |
| Zerstäubergas: | 3 l/min |
| Trocknungsgas: | 20 l/min |
| Heizblock: | 400 oC |
| Desolvation line: | 200 oC |
| VAL: | 355,20 m/z → 152,05 m/z |
| GAL: | 255,80 m/z → 152,00 m/z; 255,80 m/z → 134,90 m/z |
| ACI: | 226,00 m/z → 152,00 m/z; 226,00 m/z → 134,95 m/z |
| Registrierungszeit: | 0,00 – 7,00 min |
Ergebnisse und Diskussion
Methodenentwicklung
Eine chromatographische Trennmethode für Valganciclovir und Ganciclovir zu entwickeln, ist aufgrund ihrer geringen Retention auf „klassischen“ Octadecyl-Säulen eine Herausforderung. Ein Einsatz von Säulen mit Aminogruppen lieferte keine gute Retention und keine korrekte Trennung von VAL und GAL. Eine Idee bestand darin, C18-Säulen mit unterschiedlichem Gesamtkohlenstoffgehalt (Tabelle 4) zu testen.
Die besten Ergebnisse wurden mit einer Shim-Pack GWS-Säule mit geringstem Gesamtkohlenstoffgehalt erzielt. Trotz der unwesentlichen Retention von Valganciclovir und Ganciclovir auf dieser Säule, waren die chromatographischen-Peaks vom Totvolumen getrennt, und die Methode erfüllte die regulatorischen Anforderungen für eine Validierung, einschließlich der „Selektivitäts“-Parameter.
Methodenvalidierung
Die Methode wurde validiert gemäß Richtlinien zur Arzneimittelprüfungen [12] sowie der FDA- [13] und EMA-Richtlinien [14] für folgende Parameter: Selektivität, Matrixeffekt, Kalibrationskurve, Genauigkeit und Präzision, Rückgewinnung, untere Quantifizierungsgrenze, Verschleppung und Stabilität.
Selektivität
Sechs intakte, aus unterschiedlichen Quellen gezogene Plasmaproben ebenso wie intakte Plasmaproben wurden getestet; sie waren mit Arbeitslösungen von Valganciclovir und Ganciclovir (5 bzw. 50 ng/ml) versetzt. Zusätzlich wurden intakte Plasmaproben mit Hämolyse und Proben mit erhöhtem Lipidgehalt analysiert. Im Falle von plasma-freien Chromatogrammen (Abbildung 3) überschritt die Intensität der Peaks mit der gleichen Retentionszeit wie die Zielsubstanzen keine 20 % des Signals bei der LLOQ (Lower Limit Of Quantification) und 5 % des internen Standardsignals.
| Chromatographie-Säule | Gesamtkohlenstoffgehalt, % |
Oberfläche, m²/g |
|
Phenomenex Luna C18(2) 50 × 2 mm, 5 µm |
18,2 | 393 |
| Phenomenex Luna NH2 50 × 3 mm, 5 µm | 10,2 | 420 |
|
Waters XBridge C18 50 × 4,6 mm, 3,5 µm |
18,0 | 178 |
|
YMC Hydrosphere C18 100 × 2 mm, 3 µm |
12,2 | 330 |
|
Shim-pack GWS 150 × 4,6 mm, 5 µm |
9,5 | 450 |
Matrixeffekt
Proben mit Zugabe von Arbeitslösungen von Valganciclovir, Ganciclovir und Acyclovir ebenso wie dotierte Plasmaproben wurden untersucht, um einen Matrixeffekt abzuschätzen. Der Matrixeffekt wurde für niedrige (L) und hohe (H) Konzentrationsniveaus
| # | Mf von GAL (Level L) | Mf von ACI (Level L) | Normalisierter Mf (Level L) | Mf von GAL (Level H) | Mf von ACI (Level H) | Normalisierter Mf (Level H) |
| 1 | 0,91 | 1,00 | 0,90 | 1,00 | 0,99 | 1,01 |
| 2 | 0,87 | 1,00 | 0,87 | 0,99 | 1,02 | 0,97 |
| 3 | 0,91 | 1,01 | 0,90 | 0,98 | 0,99 | 0,99 |
| 4 | 0,92 | 1,02 | 0,91 | 1,01 | 1,01 | 1,00 |
| 5 | 0,90 | 0,99 | 0,91 | 0,99 | 1,02 | 0,97 |
| 6 | 0,94 | 1,01 | 0,93 | 1,01 | 1,02 | 0,99 |
| Durchschnitt | 0,90 | Durchschnitt | 0,99 | |||
| CV, % | 2,18 | CV, % | 1,50 | |||
| # | Mf von GAL (Level L) | Mf von ACI (Level L) | Normalisierter Mf (Level L) | Mf von GAL (Level H) | Mf von ACI (Level H) | Normalisierter Mf (Level H) |
| 1 | 1,18 | 1,00 | 1,17 | 1,04 | 0,99 | 1,04 |
| 2 | 0,98 | 1,00 | 0,98 | 0,82 | 1,02 | 0,81 |
| 3 | 0,97 | 1,01 | 0,97 | 0,84 | 0,99 | 0,85 |
| 4 | 1,14 | 1,02 | 1,12 | 0,99 | 1,01 | 0,98 |
| 5 | 1,29 | 0,99 | 1,30 | 0,85 | 1,02 | 0,84 |
| 6 | 1,21 | 1,01 | 1,19 | 1,00 | 1,02 | 0,98 |
| Durchschnitt | 1,12 | Durchschnitt | 0,92 | |||
| CV, % | 11,56 | CV, % | 10,58 | |||
Kalibrationskurven
Neun intakte Plasmaproben, versetzt mit Acyclovir, Valganciclovir und Ganciclovir entsprechend der Konzentrationsniveaus 1-9
Genauigkeit und Präzision
Versetzte Plasmaproben bei LLOQ-, hohen, mittleren und niedrigen Konzentrationsniveaus
| Injiziert (ng/ml) |
Durchschnittlich gefunden, ng/ml |
SD | RSD, % | E, % | ||||||||
| (n = 5) | (n = 10) | (n = 15) | (n = 5) | (n = 10) | (n = 15) | (n = 5) | (n = 10) | (n = 15) | (n = 5) | (n = 10) | (n = 15) | |
| Valganciclovir | ||||||||||||
| 5,00 | 5,80 | 5,45 | 5,29 | 0,08 | 0,62 | 0,56 | 1,37 | 11,35 | 10,53 | 16,08 | 8,96 | 5,89 |
| 15,00 | 14,46 | 14,08 | 13,72 | 0,62 | 0,75 | 0,80 | 4,26 | 5,31 | 5,86 | -3,63 | -6,11 | -8,52 |
| 500,00 | 550,73 | 561,04 | 563,16 | 5,21 | 12,53 | 10,69 | 0,95 | 2,23 | 1,90 | 10,15 | 12,21 | 12,63 |
| 800,00 | 893,66 | 901,00 | 900,88 | 12,41 | 13,06 | 12,59 | 1,39 | 1,45 | 1,40 | 11,71 | 12,62 | 12,61 |
| Ganciclovir | ||||||||||||
| 50,00 | 48,32 | 47,39 | 47,18 | 1,13 | 2,33 | 2,06 | 2,33 | 4,91 | 4,37 | -3,35 | -5,21 | -5,65 |
| 150,00 | 145,73 | 143,35 | 141,91 | 6,62 | 6,30 | 5,73 | 4,27 | 4,39 | 4,04 | -2,85 | -4,44 | -5,39 |
| 5000,00 | 4740,25 | 4808,83 | 4892,22 | 77,26 | 104,66 | 153,94 | 1,63 | 2,18 | 3,15 | -5,19 | -3,82 | -2,16 |
| 8000,00 | 7198,32 | 7372,03 | 7482,18 | 146,29 | 225,72 | 252,41 | 2,03 | 3,06 | 3,37 | -10,02 | -7,85 | -6,47 |
Rückgewinnung
Drei versetzte Plasmaproben bei niedrigen, mittleren und hohen Konzentrationsbereichen ebenso wie QC-Proben wurden für die Abschätzung der Rückgewinnungsrate getestet. Und zusätzlich die Plasmaproben mit Hämolyse und erhöhtem Lipidgehalt überprüft. Erzielte Ergebnisse zeigt Tabelle 8. Entsprechend der Bestimmungen sollte eine Rückgewinnung 100 % nicht erreichen. Es ist jedoch notwendig, eine effiziente und reproduzierbare Extraktion von Zielsubstanzen aus biologischen Matrizes sicherzustellen. RSD des Rückgewinnungswerts sollte 15 % nicht überschreiten.
| Rückgewinnung (Level L), % | Rückgewinnung (Level M), % | Rückgewinnung (Level H), % | |
| Valganciclovir | |||
| Durchschnitt | 88,57 | 98,94 | 101,80 |
| SD | 6,78 | 2,76 | 2,48 |
| RSD | 7,66 | 2,79 | 2,43 |
| Ganciclovir | |||
| Durchschnitt | 93,98 | 90,95 | 98,01 |
| SD | 8,64 | 9,83 | 4,44 |
| RSD | 9,20 | 10,80 | 4,53 |
Untere Quantifizierungsgrenze
Das LLOQ-Level wurde basierend auf Linearitäts-, Genauigkeits- und Präzisionsdaten bestimmt. Die minimalen Valganciclovir- und Ganciclovir-Konzentrationen im Plasma, für die es möglich ist, VAL und GAL mit RSD- und E-Werten von nicht mehr als 20 % zu quantifizieren, wurden für die Methode als LLOQ festgelegt. Der LLOQ betrug 5,00 ng/ml für Valganciclovir und 50,00 ng/ml für Ganciclovir. Chromatogramme von in Plasma enthaltenem VAL und GAL am LLOQ-Niveau sind in Abbildung 7 wiedergegeben. Die Nachweisgrenze von Valganciclovir lag bei etwa 0,93 ng/ml und die von Ganciclovir bei etwa 0,73 ng/ml (Signal/Rauschverhältnis ca. 3:1).
Stabilität
Die kurzzeitige Stabilität der aufbereiteten Proben (Autosampler- und Bench-Top-Stabilität) wurde bei niedrigen und höheren Konzentrationsniveaus bestätigt, ebenso die Lösungsstabilität der Zielsubstanzen anhand von drei Frost-Auftau-Zyklen sowie ihre Langzeitstabilität (Aufbewahrung für 30 und 59 Tage bei einer Temperatur von -45 °C).
Verschleppung
Es gab keine Peaks mit einer Retention der Zielsubstanzen im Chromatogramm, wenn Plasma-Leerproben nach den Kalibrationsproben mit den höchsten Konzentrationen von Valganciclovir und Ganciclovir analysiert wurden.
Fazit
Eine LC-MS/MS-Methode zur Bestimmung von Valganciclovir und Ganciclovir in menschlichem Plasma wurde entwickelt und validiert. Geprüfte Konzentrationsbereiche im Plasma lagen bei 5-1.000 ng/ml für Valganciclovir und 50-10.000 ng/ml für Ganciclovir. Dies erlaubt es, die Methode für pharmakokinetische Untersuchungen sowie für die therapeutische Arzneimittelüberwachung einzusetzen.
Literatur
- Karpov I. A., Salavei M. U.
Valganciclovir as a highly effective drug for the prevention and treatment of herpes infections.
Meditsinskie novosti. 2018;3:56-59. (In Belarus) - Xu H.-R., Li X.-N., Chen W.-L., Liu G.-Y., Chu N.-N., Yu C.
A sensitive assay for simultaneous determination of plasma concentrations of valganciclovir and its active metabolite ganciclovir by LC/MS/MS.
Journal of Chromatography B. 2007;848(2):329-334. DOI: 10.1016/j.jchromb.2006.10.053 - Singh O., Saxena S., Mishra S., Khuroo A., Monif T. Determination of valganciclovir and ganciclovir in human plasma by li quid chromatography tandem mass spectrometric detection.
Clinical Biochemistry. 2011;44(10-11):907-915. DOI: 10.1016/j. clinbiochem.2011.04.003 - Valganciclovir. DRUGBANK. Available at: https://go.drugbank.com/drugs/DB01610
- Ganciclovir. DRUGBANK. Available at: https://go.drugbank.com/drugs/DB01004
- Acyclovir. DRUGBANK. Available at: https://go.drugbank.com/drugs/DB00787
- Teshima D., Otsubo K., Yoshida T., Itoh Y., Oishi R.
A simple and simultaneous determination of acyclovir and ganciclovir in human plasma by high‐performance liquid chromatography.
Biomedical Chromatography. 2003;17(8):500-503. DOI: 10.1002/bmc.258 - Padullés A., Colom H., Armendariz Y., Cerezo G., Caldes A., Pou L., Torras J., Grinyó J. M., Lloberas N.
Determination of ganciclovir in human plasma by ultra performance liquid chromatography – UV detection.
Clinical Biochemistry. 2012;45(4-5):309-314. DOI:10.1016/j.clinbiochem.2011.12.014 - Heinig K., Wirz T., Gajate-Perez A., Belli S. Determination of Ganciclovir and its prodrug Valganciclovir by hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B. 2011;879(5-6):436-442. DOI: 10.1016/j. jchromb.2010.12.033
- Dogan-Topal B., Ozkan S. A., Uslu B.
Simultaneous determination of abacavir, efavirenz and valganciclovir in human serum samples by isocratic HPLC-DAD detection.
Chromatographia. 2007;66(1):25-30. DOI: 10.1365/s10337-007-0302-y - Komarov T. N., Shohin I. E., Miskiv O. A., Bogdanova D. S., Aleshina A. V., Medvedev Yu. V., Bagaeva N. S.
Development and Validation of Valganciclovir and its Active Metabolite Ganciclovir Determination in Human Plasma by HPLC-UV Method. Razrabotka i registratsiya lekarstvennykh sredstv = Drug development & registration. 2020;9(2):133-139. (In Russ.) DOI: 10.33380/2305-2066-2020-9-2-133-139 - Mironov A. N. Rukovodstvo po ekspertize lekarstvennykh sredstv [Guidelines for the examination of medicines]. V. II. Moscow: Grif i K; 2013: 280 p. (In Russ.)
- Food and Drug Administration. Available at: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/bioanalytical-method-validation-guidance-industry
- European Medicines Agency. Available at: https://www.ema.europa.eu/en/bioanalytical-method-validation
