Bisquaternäres Ammoniumaddukt mit Trifluoracetat
MSn-Fragmentierungsanalyse eines bisquaternären Ammonium-Trifluoracetat-Addukts
Marta Kowalska, Dr. Remigiusz Bąchor, Faculty of Chemistry, University of Wroclaw
Trifluoracetat (TFA) ist ein mobiler und langlebiger Stoff, der vor allem durch den Abbau verschiedener Fluorchemikalien in den Wasserkreislauf gelangt und langfristig in der Umwelt verbleibt. Es ist auch als Ionenpaarungsmittel bekannt und verringert die Signalintensität im ESI-MS-Spektrum. Nichtsdestotrotz könnte die Untersuchung seiner Bindung durch Massenspektrometrie einen bedeutenden Einfluss auf die Forschung zur Entwicklung entsprechender Sensoren haben.
Im Rahmen dieser Studie wird gezeigt, dass es möglich ist, ein stabiles bisquaternäres Addukt mit Trifluoracetat zu identifizieren, das zur Bildung von charakteristischen Fragmentionen im MSn-Modus führt, die ein kovalent gebundenes Anion enthalten. Für dieses Phänomen ist eine Reorganisation der Bindungen erforderlich, die zu einer Ladungsretention am Stickstoffatom führt.
Die Bildung von Addukten ist ein häufiges Phänomen bei der Analyse mit der Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (ESI-MS).[1] Häufig treten Kalium-, Natrium-, Ammonium- oder Lithiumaddukte im positiven Ionenmodus [2] und Chloraddukte im negativen Ionenmodus auf.[3, 4] Trifluoressigsäure kann im positiven Ionenmodus der ESI-MS-Addukte mit positiv geladenen Analytionen bilden, wodurch die Signalintensität im Massenspektrum verringert wird. Dieses Phänomen ist auf die weit verbreitete Verwendung von TFA als Zusatzstoff in der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) zurückzuführen. Die Verwendung von TFA führt zu einer Verbesserung der chromatographischen Peak-Form aufgrund der Verringerung des Silanolgruppeneffekts von Säulen.[5] Bei der massenspektrometrischen Analyse ist das Verständnis der Wechselwirkung zwischen zwei assoziierten Molekülen aus einer mechanistischen und biologischen Perspektive von großer Bedeutung. Bestimmte Verbindungen weisen bei der ESI-MS-Analyse eine geringe Ionisierungseffizienz auf, die ihre zuverlässige Erkennung einschränkt. Wie bereits erwähnt, kann die Anwesenheit von Anionen (z. B. dem TFA-Anion) zu einer Verringerung der Signalintensität im MS-Spektrum führen, was bei der Analyse bestimmter schwer ionisierbarer Verbindungen eine Herausforderung bedeuten kann. Die Verwendung von festen Ladungsträgern (z. B. quaternären Ammoniumsalzen) stellt einen der Ansätze dar, mit denen sich die Effektivität der Ionisierung und die Nachweisempfindlichkeit verbessern lassen.[6] Quaternäre Ammoniumkationen sind stickstoffhaltige Ionen mit vier an den Stickstoff gebundenen Aryl- oder Alkylketten (NR4+-Struktur). Folglich besitzen quaternäre Ammoniumkationen eine konstant positive Ladung.[7] Durch die Anwendung von quaternären Ammoniumsalzen können die Einschränkungen der ESI-MS/MS-Analyse aufgrund der Einführung einer positiven Ladung verringert werden, was die Analyse von Verbindungen mit geringer Ionisierungseffizienz ermöglicht.[6]
Höhere Ionisierungseffizienz durch Pyridiniumgruppe
Pyryliumsalze sind ein Beispiel für eine Verbindung, die aufgrund des Vorhandenseins eines positiv geladenen Sauerstoffatoms eine konstant positive Ladung aufweist. Infolge der hohen Reaktivität dieses Atoms gegenüber Nukleophilen werden Pyryliumsalze zur Herstellung von Pyridiniumderivaten verwendet, d. h. von Verbindungen, die das quaternäre Ammoniumatom enthalten. Das Vorhandensein der Pyridiniumgruppe mit ihrer konstant positiven Ladung erhöht die Effizienz der Ionisierung, was wiederum eine erhöhte Empfindlichkeit zur Folge hat, z. B. beim Nachweis von Peptiden.[8]
In der vorliegenden Arbeit wurde die Bildung eines nicht kovalenten bisquaternären Ammonium-Trifluoracetat-Addukts in der Gasphase beschrieben, auch während eines MS/MS-Versuchs mit Überwachung durch den Shimadzu LCMS-IT-TOF (Shimadzu, Kyoto, Japan).
Das Modell der bisquaternären Ammoniumverbindung in Form von 2,2’-Disulfanediylbis(2,4,6-Triphenylpyridinium)((TPP)2-CYSTAM) wurde durch die Reaktion zwischen 2,4,6-Triphenylpyryliumtetrafluoroborat und Cystamin in Gegenwart von N,N,N-Triethylamin synthetisiert. Die synthetisierte Verbindung wurde mittels Umkehrphasen-HPLC aufgereinigt, wobei Trifluoressigsäure als Zusatz für die mobile Phase verwendet wurde. Die aufgereinigte Verbindung wurde dann mittels ESI-MS analysiert (Abbildung 1). Die Analyse mittels (TPP)2-CYSTAM-Massenspektrometrie im positiven Ionenmodus ergab das Vorhandensein des Signals bei m/z 367,139, was dem M2+-Ion entspricht. Die Analyse mittels ESI-MS und ESI-MS/MS bestätigte den Erfolg der Synthese.
Außerdem offenbarte das ESI-MS-Spektrum (Abbildung 1) das Vorhandensein des Signals bei m/z 847,263 (M11+). Das Isotopenmuster des Signals bei m/z 847,263 (M11+) war nahezu identisch mit dem des Signals bei m/z 367,139 (M2+). Eine detaillierte Analyse ergab, dass das Signal bei m/z 847,263 dem einfach positiv gelandenen Ion entspricht, das zwei Schwefelatome enthält. Die Masse des gebildeten Ions war um 113 Da höher als die Masse der bisquaternären Ammoniumverbindung (M2+-Ion), was charakteristisch für Trifluoracetat ist (112,986 Da). Wie bereits erwähnt, kann in der mobilen Phase verwendetes TFA zu Suppressionseffekten führen und die Signalintensität verringern.[5] Das (TPP)2-CYSTAM weist jedoch zwei positive Ladungen auf, wobei bei der Bildung des (TPP)2-CYSTAM-TFA-Addukts nur eine positive Ladung neutralisiert wird. Dies führt zur Bildung eines einfach geladenen nicht kovalenten Addukts, das in der Gasphase stabil ist. Zur Kontrolle der Stabilität des (TPP)2-CYSTAM-TFA-Addukts wurde eine ESI-MS/MS-Analyse durchgeführt (Abbildung 2).
Fragmentierung des Vorläuferions
Generell weist das in der ESI-MS gebildete Addukt bei ESI-MSn-Versuchen keine andere Fragmentierung als den Verlust von Kationen oder Anionen auf. Aus diesem Grund wurde eine Fragmentierung des Vorläuferions bei m/z 847,263 (M1+) durchgeführt. Eines der charakteristischsten Fragmentionen war das [M1a]+-Ion bei m/z 308,143, was der protonierten Form von 2,4,6-Triphenylpyridin (TPP) entspricht. TPP ist ein allgemein bekanntes Reporterion, das bei der Fragmentierung TPP-modifizierter Peptide gebildet wird.[8] Neben dem [M1a]+-Ion wurden bei der Fragmentierung die Fragmentionen [M1b]+, [M1c]+, [M1d]+ bei m/z 334,158, 366,131 und 426,134 gebildet, was für die Dissoziation der Fragmente der bisquaternären Ammoniumverbindung charakteristisch ist (Abbildungen 2 und 3).
Wenn das gebildete Addukt in der Gasphase stabil ist, sollte der Teil des Moleküls, der nach der Dissoziation mit einem positiv geladenen quaternären Stickstoffatom verbleibt, durch das Vorhandensein des Trifluoracetatanions neutralisiert werden. Das gewonnene Massenspektrum zeigt jedoch auch andere den Fragmentionen entsprechende Signale, deren Masse nicht auf den Verlust des TFA-Anteils hinweist. Eine detaillierte Analyse ergab, dass die Signale, die die Ionen bei m/z 436,152 [M1e]+, 480,124 [M1f]+ und 540,127 [M1g]+ charakterisieren, von den TFA-Addukten mit einem einfach geladenen Stickstoffatom stammen.
Die Identifizierung von Signalen, die positiv geladene Ionen in Form von Trifluoracetataddukten charakterisieren, ist nicht einfach, da dafür entweder eine zusätzliche Ladungsbildung oder eine Reorganisation der chemischen Bindungen erforderlich wäre. Darüber hinaus sind die m/z-Werte der im gewonnenen ESI-MS/MS-Spektrum dargestellten Signale für die Fragmentionen, die den TFA-Addukten entsprechen, im Vergleich zur nicht kovalenten Form des TFA-Addukts um 1 Da verschoben, was auf das Auftreten einer Bindungsreorganisation hinweisen kann. Die gebildeten Ionen und die entsprechenden m/z-Werte sind in Abbildung 3 schematisch dargestellt. Darüber hinaus ergab die ESI-MS3-Analyse des Vorläuferions [M1g]+ bei m/z 540,127 die Bildung eines Fragmentions bei m/z 480,124, das ebenfalls dem TFA-Addukt entspricht ([M1f]+).
Grundlage für einen zukünftigen Anionensensor für Umweltproben
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich die Bildung eines stabilen bisquaternären Ammoniumtrifluoracetat-Addukts in der Gasphase in ESI-MS-Versuchen nachwiesen ließ, das nicht zur Ionensuppression führt. Die MS/MS-Analyse zeigte, dass elektrostatische Wechselwirkungen zwischen der bisquaternären Ammoniumverbindung und dem Trifluoracetatanteil in Gegenwart von Kollisionsenergie in kovalente Bindungen umgewandelt werden können. Das TFA-Anion bildet eine stabile N-O-Bindung mit dem bisquaternären Ammoniumkation (bestätigt durch Berechnungsmethoden auf der Grundlage von DFT), was die Stabilität des so entstehenden Addukts erhöht. Für die Umwandlung in ein kovalentes System sind eine Reorganisation der Bindungen und eine Ladungsretention am Stickstoffatom erforderlich. Dieses Phänomen ermöglicht die Beobachtung der Fragmentionen, die den TFA-Anteil enthalten. Die erwähnten Wechselwirkungen und das Potenzial für ihre Analyse in der Zukunft könnten zur Entwicklung eines Anionensensors führen, der zur Erkennung bestimmter anionischer Verbindungen in Umweltproben eingesetzt werden kann. Die Ergebnisse der durchgeführten Forschungsarbeiten verbessern das Potenzial der Massenspektrometrie bei der Identifizierung von Wechselwirkungen zwischen Kationen und Anionen in der Gasphase erheblich. Dadurch kann diese Technik zur Identifizierung bestimmter Anionen in Proben eingesetzt werden.
Das Forschungsprojekt wird (teilweise) durch das Programm „Exzellenzinitiative – Forschungsuniversität“ unterstützt, das von 2020 bis 2026 andauert.
Der Autor möchte Andrzej Reszka (Shim-Pol, Polen) für die Bereitstellung des Shimadzu LCMS-IT-TOF danken.
[1] Kruve, A., Kaupmees, K. (2017).J A So Mass Spectrom. 28: 887–894.
[2] Steckel, A., Schlosser, G. (2019). Molecules. 24: 611.
[3] Kuksis, A., Marai, L., Myher, J.J. (1991). J Chromatogr A. 588: 73–87.
[4] Kuksis, A., Marai, L., Myher, J.J. (1991). Lipids. 26: 240–246.
[5] Wouters, S., Eeltink, S., Haselberg, R., Somsen, G.W., Gargano, A.F.G. (2021). Anal Bioanal Chem. 413: 4379–4386.
[6] Bąchor, R., Mielczarek, P., Rudowska, M., Silberring, J., Szewczuk, Z. (2014). Int J Mass Spectrom. 362: 32–38.
[7] Shackman, H.M., Ding, W., Bolgar, M.S. (2015). J Am Soc Mass Spectrom. 26: 181–189.
[8] Waliczek, M., Bąchor, R., Kijewska, M., Panek-Laszczyńska, K., Konieczny, A., Dąbrowska, K., Witkiewicz, W., Marek-Bukowiec, K., Tracz, J., Łuczak, M., Szewczuk, Z, Stefanowicz, P. (2019). Anal Chim Acta. 1048: 96–104.
